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摘要
目的：具核梭杆菌（Fusobacteriumnucleatum，F.nucleatum）是人类主要栖息于口腔的微生物群的组成部分。它会引起牙周病，也与人类癌症的发展有关。虽然有许多关于具核梭杆菌与人类癌症临床结局之间关系的报道，但其在食管癌中的预后意义尚不清楚。
实验设计：采用qPCR对例食管癌切除标本中的具核梭杆菌DNA进行定量分析。利用基因芯片数据，通过基因组（KEGG）富集分析，确定了具核梭杆菌阳性食管癌组织中的重要途径。
结果：食管癌组织中具核梭杆菌DNA含量明显高于正常食管粘膜（P0.；n60）。例中有74例（23%）检测到具核梭杆菌的DNA。具核梭杆菌DNA阳性与肿瘤分期显著相关，但与性别、年龄、行为状态、吸烟、饮酒、组织学、肿瘤部位或术前治疗无关。具核梭杆菌DNA阳性与肿瘤特异性生存率也显著相关[对数秩P0.；单变量HR2.01；95%可信区间区间（CI），1.22-3.23；P0.；多变量HR1.78；95%CI，1.06-2.94；P0.]。具核梭杆菌阳性组织中排名第一的KEGG途径是“细胞因子-细胞因子-受体相互作用”，IHC证实了具核梭杆菌与趋化因子CCL20之间的显著关系。
结论：具核梭杆菌感染的食管癌组织中有较短的生存期，提示Fn有可能作为一种预后生物标志物。Fn也可能通过活化趋化因子（如CCL20）参与肿瘤的侵袭行为。
介绍
食管癌是全世界男性癌症相关死亡的第五大常见原因，也是女性癌症相关死亡的第八大常见原因。尽管发展了多种疗法，包括手术、化疗、放疗和放化疗，但患者的预后，包括那些接受完全切除的患者，仍然很差。因此，需要进一步的研究来阐明食管癌的发病机制，并探索新的诊断和治疗的可能性。此外，对食管癌新的预后或预测性标志物的鉴定可以改进风险适应治疗策略的使用，并有助于在未来的临床试验中对针对这些肿瘤特征的药物患者进行分层。
对微生物组的研究是人类癌症中一个迅速发展的领域。超过万亿的细菌栖息在人体内，在各个器官中形成自己的菌群（微生物群）。肠道微生物群最近被证明在健康和疾病中起着重要的作用，如肥胖症、炎症性肠病、糖尿病、非酒精性脂肪肝，以及一些类型的癌具核梭杆菌（有核细胞；一种非孢子形成的厌氧革兰氏阴性细菌）是人类口腔、阴道和胃肠粘膜正常菌群的一部分。它被认为是牙周病，绒毛膜羊膜炎和炎症性肠病的病原体。关于具核梭杆菌与胃肠道肿瘤的关系，亚基因组分析显示，在结直肠癌组织中具核梭杆菌数量过多。具核梭杆菌也被证明可以激活结直肠癌细胞中的WNT/b-catenin信号通路，并可能促进肿瘤生长。最近的研究表明，高水平的具核梭杆菌DNA与人类癌症的预后不良有关，而其他研究则表明具核梭杆菌DNA水平与患者生存率没有关系。然而，迄今为止还没有研究探讨具核梭杆菌对食管癌组织预后的影响。
在这项研究中，我们应用qPCR技术检测例食管癌切除标本中的具核梭杆菌细胞核DNA并探讨其预后价值。我们还澄清了其中的机制。通过对基因组（KEGG）途径的富集分析，有核肿瘤可能导致预后不良。本研究结果提示具核梭杆菌可能作为食管癌预后的生物标志物。
材料和方法
研究组
分析了年4月至年6医院（日本熊本市）接受手术的例福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）食管癌标本。肿瘤分期根据美国癌症分期联合委员会手册进行。绝大多数病例被诊断为鳞状细胞癌，其中鳞状细胞癌例（92%），腺癌12例（3.7%），其他13例（4.0%）。共有名患者接受了术前治疗[73例化疗（顺铂、5-氟尿嘧啶加或不加多西紫杉醇）44例放化疗]。观察时间间隔为1至3个月，直至死亡或年1月31日，以先到者为准。总生存率（OS）定义为从手术日期到死亡日期的时间。肿瘤特异性生存率定义为自手术之日起至食管癌死亡之日。每个受试者均获得书面知情同意，研究程序由机构审查委员会批准。根据评论指南，本文中使用了术语“预测标记”。
具核梭杆菌DNA提取及qPCR研究
用QIAamp-DNA-FFPE组织试剂盒（Qiagen）从FFPE食管癌组织中提取基因组DNA。采用qPCR法测定具核梭杆菌DNA含量。利用定制的TaqMan引物/探针组（AppliedBiosystems）扩增了具核梭杆菌nus-G基因和人参考基因SLCO2A1。每个自定义TaqMan基因表达分析的引物和探针序列如下：具核梭杆菌前向引物，50-tggtcattcaaatatca-30；具核梭杆菌反向引物，50-agatcaaggattgga-30；具核梭杆菌核仁FAM探针，50-actttaactactctacatgcttca-30；SLCO2A1前向引物，50atccaaagcatgttt-30；SLCO2A1反向引物，50agaggccagatagtcctggtaa-30；SLCO2A1VIC探头，50ccatccatgtcctctcc-30。在孔光学PCR板上进行检测。用LightCycler仪器II（Roche）在以下反应条件下扩增和检测DNA：95℃时的初始变性10分钟，95℃15秒，60℃60秒，每个组织中具核梭杆菌DNA的数量相对于SLCO2A1是正常的。
免疫组织化学染色
FFPE组织在3～5mm处连续切片，脱蜡，二甲苯脱蜡，然后通过一系列分级醇进行再水化。样品在微波炉中在Histofine（pH4-9.0；Nichirei）中煮沸15分钟，以增加抗原回收率。内源性过氧化物酶经3%过氧化氢酶处理30min后被阻断。将载玻片与一级抗体（巨噬细胞炎性蛋白3a兔单克隆抗体1:50稀释液（CC趋化因子半胱氨酸基序趋化因子配体20，CCL20；ab；Abcam））孵育一晚，孵育时间为4，使用EnvisionPlus检测系统（Dako）的无生物素辣根过氧化物酶标记聚合物进行检测。切片在3，3-二氨基联苯胺中展开，并用迈尔苏木精复染。然后通过分级醇将载玻片脱水，并用盖玻片覆盖。检测CCL20阳性肿瘤细胞的染色强度和百分率。根据阳性肿瘤细胞的百分比，半定量分类染色范围0-5%阳性细胞）、1（6%-25%阳性细胞）、2（26%-50%阳性细胞）、3（51%-75%阳性细胞）和4（75%以上阳性细胞）。细胞质和膜染色强度半定量测定如下：0（阴性）、1（弱阳性）、2（中度阳性）和3（强阳性）。切片评分定义为“染色程度”。
微阵列和KEGG途径富集分析
用RNeasy微型试剂盒（Qiagen）从10例食管癌活检标本冰冻切片中提取总RNA。基因表达微阵列分析使用SurePrintG3人类GE微阵列8，60K以上。2.0（安捷伦技术）符合制造商协议。通过比较食管癌组织中RNA表达水平，筛选差异表达基因（DEG）。核细胞-阳性和核细胞-阴性组，使用Subio平台（Subio公司）。利用注释数据库、可视化数据库和综合发现6.7软件，对KEGG途径富集分析进行了鉴定，以确定所鉴定的DEG所代表的生物功能和途径。
统计分析
所有统计分析均采用JMP第10版（SAS研究所）进行。所有的P值都是双面的。我们用t检验来比较年龄和体重指数的平均值，用c2or-Fisher精确检验来比较所有其他变量的平均值。生存分析中的生存时间分布由使用对数秩检验的Kaplan-Meier方法。我们构建了一个多变量模型来计算基于细胞核DNA状态的HR，包括性别（男性vs.女性）、手术年龄（65岁）、手术年份（-与-）、吸烟（是与否）、饮酒（是与否）、表现状态（0与1）、肿瘤部位（上与下）、肿瘤分期（I和II与III和IV）以及术前治疗（缺席与在场）。在Cox模型中，通过包括具核梭杆菌DNA状态的交叉产物和另一个感兴趣的变量来评估相互作用。
结果
qPCR法检测食管癌组织中有核梭状芽胞杆菌DNA的相对含量。具核梭杆菌食管癌组织的细胞核DNA水平高于配对的非肿瘤组织（n/60，P/0.；图1A）。我们还测量了相对论。例食管癌组织中的核酸水平。例中有74例（23%）检测到有具核梭杆菌（图1B）。
食管癌细胞核DNA状态与临床病理特征的关系
例具核梭杆菌感染的临床病理特征见表1。具核梭杆菌阳性率与年龄、性别、手术年限、术前表现、吸烟史、酒精史、共病、肿瘤部位、组织学、肿瘤大小、术前治疗无关（均P0.05），与肿瘤分期（P0.）、T分期（P0.01）、N分期（P0.）有关。
肿瘤细胞核DNA状态与患者生存
例食管癌患者中死亡例，其中食管癌特异性死亡75例。受检者的中位随访时间为2.6年。与具核梭杆菌阴性患者相比，患者的癌症特异性死亡率明显更高[HR为1/42.01；95%可信区间（CI）为1.22-3.23；P为1/40.；表2]。在经临床、病理和流行病学特征校正的多变量Cox模型中，具核梭杆菌阳性与癌症特异性死亡率显著升高相关（多变量HR-1.78；95%CI，1.06-2.94；P-0.；表2）。在总死亡率方面也观察到了类似的结果。
具核梭杆菌与其他变量之间相互作用的生存分析
我们确定具核梭杆菌对癌症特异性生存的影响是否被任何临床、病理或流行病学变量所改变。具核梭杆菌的作用不受年龄、手术年限、肿瘤位置、术前治疗、肿瘤大小或肿瘤分期的影响（P均0.09；图3）。值得注意的是，我们没有观察到术前治疗对具核梭杆菌与肿瘤特异性生存率之间关系的修正作用（Pinteraction为0.58）。
食管鳞状细胞癌细胞核DNA表达与患者生存率的关系
鳞癌是包括日本在内的东部地区食管癌的主要类型。因此，我们也进行了生存分析，包括仅SCC（n/）。与具核梭杆菌阴性患者相比，具核梭杆菌阳性患者的肿瘤特异性生存率显著降低（对数秩P/0.，单变量HR/2.26；95%CI，1.34-3.72；P/0.；多变量HR/1.98；95%CI，1.14-3.37；p=0.）。
具核梭杆菌阳性食管癌组织上调途径的研究
为了阐明具核梭杆菌可能导致不良预后的机制，我们利用微阵列数据对KEGG途径进行了富集分析。图4A显示了与核细胞阳性食管癌组织中显著上调的DEGs相关的前10个最富集的KEGG途径。重要的是，“细胞因子-细胞因子受体相互作用”是排名第一的途径（FDR0.，fold富集1.95）。“细胞因子-细胞因子受体相互作用”中的趋化因子DEGs（foldchange2）。我们假设具核梭杆菌肿瘤可能通过激活趋化因子参与肿瘤侵袭行为的获得。CCL20被认为是最上调的趋化因子（补充表S2），因此我们评估了CCL20在食管中的表达情况IHC检测的癌组织（图4B）。我们证实具核梭杆菌的存在与否与CCL20的表达状态显著相关（图4C）。
讨论
我们研究了例食管癌切除患者中人类有核微生物对预后的影响。越来越清楚的是，人类微生物群影响癌症的发展和进展。因此，更好地了解微生物群对人类癌症的作用机制和贡献可能有助于开发新的癌症治疗和或预防方法。据我们所知，目前的研究为具核梭杆菌与食管癌预后不良之间的关系提供了第一个证据。此外，利用KEGG富集分析，我们证明具核梭杆菌可能通过激活趋化因子，如CCL20，促进肿瘤侵袭行为的获得。
以前关于具核梭杆菌与人类癌症临床结局之间关系的研究一直没有定论（补充表S1）。两项研究报道肿瘤具核梭杆菌与结直肠癌患者预后不良相关。Mima和他的同事分析了0多个结直肠癌的分子病理流行病学数据库，发现结直肠癌组织中的细胞核DNA水平与较短的生存期相关，而Flanagan和他的同事证明了两者之间的关系。例结直肠癌的细胞核肿大与预后不良。关于胰腺癌，Mitsuhashi和他的同事报告说，肿瘤具核梭杆菌状态与较差的预后独立相关。我们目前对食道癌的研究结果与之前的结果一致。然而，与之相反的是，另外两项结直肠癌研究（分别为n0/和n0/）发现具核梭杆菌检测与临床结果之间没有关联。这种差异可能归因于患者队列的差异或用于评估具核梭杆菌种类的方法的差异，或者仅仅是独立研究之间的偶然差异。然而，我们的研究结果表明，在食管癌组织中增加具核梭杆菌使预后不良，提示具核梭杆菌可能是一种合适的生物标记物，用于鉴别可能出现不良结局的患者。
实验研究为具核梭杆菌与肿瘤进展的关系提供了机制上的见解。已知具核梭杆菌细胞核在细菌细胞表面表达新的粘附蛋白FadA。Rubinstein及其同事在体内外模型中发现FadA可以与E-cadherin结合，激活b-catenin信号，促进结直肠癌细胞增殖。他们还报告说，大肠癌组织显示fadA基因水平升高，表明fadA作为人类癌症的诊断和治疗靶点具有潜在的作用。在ApcMin/t小鼠模型中，核肿瘤被证明抑制T细胞介导的对大肠癌的免疫反应并促进肿瘤进展。另一项使用大肠癌样本的研究显示，组织水平下降之间存在反向关联。肿瘤组织中的细胞核dna和CD3tT细胞密度。总之，这些结果表明，具核梭杆菌可能通过抑制人类T细胞反应而发挥免疫抑制作用。第三种可能的机制涉及肿瘤免疫微环境的调节。体内研究表明，具核梭杆菌的定植刺激了免疫细胞因子的分泌，导致结肠癌的发生。此外，我们的研究表明，“细胞因子-细胞因子受体相互作用是具核梭杆菌阳性食管癌中最上调的途径，从而支持这第三种可能的机制。
越来越多的证据表明趋化因子及其受体在几种癌症的肿瘤发展和进展中起着关键作用。Kretschmer及其同事最近报道食管鳞癌细胞调节成纤维细胞趋化因子表达，影响肿瘤免疫反应。在目前的研究中，具核梭杆菌阳性食管癌中最上调的趋化因子是CCL20。近年来，越来越多的研究
